Ситуація в Київській митрополії мало відрізнялася від обстановки, що панувала в Європі перед Реформацією та початком реформ католицької церкви. Вона була багато в чому стандартною, однак частина православної еліти почала сприймати її як кризову. Католицька церква Речі Посполитої була зайнята самооновленням за допомогою єзуїтських шкіл та колегіумів, що являло загрозу для ще не реформованого православ’я. Видавнича та просвітницька діяльність кіл, що згрупувалися навколо князя Костянтина Острозького, була першою реакцією на цей виклик. Не менш стурбовані станом церковних справ були й члени православних братств — організацій купців та ремісників у великих містах України. Члени Львівського братства, найбагатшого та найвпливовішого з усіх, кинули виклик владі місцевого православного єпископа, який, як вони вважали, був корумпованим і чинив перешкоди в їхніх справах з панівними католиками. 1586 року львівські міщани домоглися ставропігії, або незалежності, від єпископа, а згодом відкрили власну школу, не чекаючи, поки він сам це зробить.
Православні ієрархи опинилися в скрутному становищі. Їхній статус у керованій католиками державі був другорядним щодо католицьких єпископів, які були членами сенату й мали прямий доступ до короля. Крім того, Острозькі й інші князі та шляхта вважали, що вони — справжні господарі церкви. Братства відверто конфліктували з ними, підриваючи монополію єпископів на викладання церковного вчення, а константинопольський патріарх, замість того щоб допомогти, взяв бунтівників під свій захист (вони знали, як підступитися до ієрарха, який страждав від безгрошів’я). Ключ до рішення цієї головоломки зненацька з’явився у вигляді унії з Римом. Бачення церковного союзу, що його уявляли собі православні ієрархи, спиралося на модель, запропоновану католицько-православним собором у Флоренції 1439 року. В останні роки існування Візантійської імперії імператор та патріарх були у відчаї, намагаючись врятувати її від нападів османів. У Римі пообіцяли допомогу в обмін на об’єднання двох церков під владою папи. Візантійські лідери погодилися на цю умову, яка підпорядковувала їхню церкву папі та замінювала православні догми на католицькі. Зокрема, вони погодили з католиками важливе питання filioque[14], що означало визнання того, що Святий Дух виходить не тільки від Бога-Отця, а й від Бога-Сина — Ісуса Христа. Разом із тим їм вдалося зберегти інститут шлюбу в священиків, грецьку мову та візантійську літургію.
Улітку 1595 року двоє українсько-білоруських православних єпископів вирушили в довгу подорож до Риму, везучи туди листа від своїх колег — православних ієрархів Речі Посполитої з проханням до папи прийняти їх у католицьку церкву на умовах, близьких до Флорентійської унії. У Римі папа Климент VIII прийняв подорожніх і привітав «повернення» єпископів та їхньої церкви в римське лоно церемонією в залі Костянтина в папському палаці. Озброєні папською буллою й численними посланнями до короля та інших високопосадовців Речі Посполитої, єпископи повернулися додому, щоб скликати собор, що мав оголосити про укладення церковної унії та передання Київської митрополії під юрисдикцію Риму. Король радо врегулював питання з часом та місцем проведення собору: він мав відбутися в жовтні 1596 року в Бересті на польсько-українсько-білоруському кордоні.
Якийсь час здавалося, що справу зроблено. Усі — папа, король, єпископи — хотіли об’єднання. Усі, крім значної кількості віруючих, до якої входили князь Острозький та його союзники серед православних магнатів, члени братств і чернецтво. Магнати не хотіли втрачати контроль над церквою — у добу Реформації вона була важливим релігійним та політичним рушієм, яким не можна було легковажити; братства хотіли реформ знизу, а не зростання влади єпископів; деякі з архімандритів, які керували монастирями, не прийнявши чернечого постригу, бажали зберегти контроль над церковними землями; і частина ченців, духівництва та звичайні віруючі, які не могли уявити собі відступництва від константинопольського патріарха. Це була кон’юнктурна, але могутня коаліція, яка ставила під загрозу плани Риму, Варшави та православних ієрархів.
Князь Костянтин Острозький, якого можна було назвати найвпливовішою людиною в Україні, був готовий майже на все, щоб запобігти церковній унії. У формі, запропонованій єпископами, вона ставила під загрозу його контроль над церквою та обмежувала можливості використання православ’я як зброї в боротьбі з королівською владою збереження особливого місця для русинських князів у суспільстві. Мабуть, він почувався особисто зрадженим. Одним із двох єпископів, які поїхали до Риму прохати про унію, був його старий друг Іпатій Потій, якого Острозький умовив відмовитися від політичної кар’єри для того, щоб той став єпископом і займався реформуванням церкви. Острозький сказав Потію, що він не проти унії, але лише за згодою константинопольського патріарха. Потій, знаючи, що такої згоди не буде, вирішив укласти унію без участі Константинополя. Попутником Потія в дорозі до Риму був єпископ Кирило Терлецький, який був не лише екзархом, або особистим представником константинопольського патріарха, призначеним захищати його інтереси в регіоні, а й єпископом Волинської єпархії — твердині Острозького.
Приголомшений старий князь відправив озброєних слуг, аби перехопити єпископів на шляху до Риму, але ті уникли небезпеки. Тепер Острозький прямував до Берестя, щоб узяти участь у соборі разом із цілою армією прихильників, що складалася з православної шляхти та його слуг. Він також мав підтримку протестантських союзників — литовських аристократів. Один із них запропонував власний будинок для проведення зборів, оскільки за наказом короля усі православні церкви в місті було зачинено. Представники короля прибули до Берестя зі своїми збройними загонами. У цій наелектризованій атмосфері очікуване об’єднання церков могло цілком імовірно перетворитися не лише на роз’єднання, а й на кровопролитну битву.
Події, відомої в історіографії під назвою «Берестейський собор», насправді ніколи не було, вона була розділена на дві окремі зустрічі — католиків та православних. Католицький собор, серед учасників якого були православний митрополит та більшість єпископів, оголосив про об’єднання. Православний собор, де головував представник константинопольського патріарха, включав двох православних єпископів, а також десятки архімандритів та представників парафіяльного духівництва. Його учасники відмовилися приєднуватися до унії і присяглися й далі зберігати вірність константинопольському патріарху. Тепер Київська митрополія була розколота: одна її частина декларувала прихильність до Риму, інша — до Константинополя. Розкол усередині митрополії мав також географічний вимір: здебільшого Галичина, зі Львовом та Перемишлем, залишилися православними, водночас Волинь та білоруські єпархії підтримали нову уніатську церкву. Насправді ситуація на місцях була набагато складнішою, ніж можна описати в загальних рисах, релігійні погляди іноді розколювали сім’ї, тоді як окремі парафії та монастирі змінювали свою прихильність не один раз.
Незважаючи на сильний опір Берестейській унії, король непорушно дотримувався унійного курсу. Він визнав лише один Берестейський собор — той, що проголосив об’єднання, — і відтепер вважав уніатську церкву єдиною законною християнською церквою східного обряду у своїй країні. Два єпископи, десятки монастирів, тисячі храмів і сотні тисяч, якщо не мільйони, православних віруючих тепер вважалися поза законом. Православна шляхта розпочала боротьбу в місцевих та загальному сеймах, заявляючи, що королівські урядовці зазіхають на свободу віросповідання, гарантовану знаті. І вона мала рацію. Ще в 1570-ті роки, відразу після смерті Сигізмунда Августа, протестантська шляхта зробила свободу віросповідання центральним принципом «артикулів», що на них мав присягати кожен новообраний король Польщі. Тепер протестантські шляхтичі підтримали своїх православних колег, допомагаючи в перетворенні сеймів на поля релігійних битв і порушуючи питання «замирення народу руського релігії стародавньої грецької» на кожному загальному сеймі. Але до смерті короля Сигізмунда III 1632 року жодних суттєвих змін не відбулося. Протягом більш ніж 30 років православна церква існувала без офіційного статусу або визнання. Оскільки нові єпископи не могли бути призначені без згоди короля, єпископи-уніати сподівалися, що православна церква залишиться без єпископів після смерті тих, хто відкинув унію. Вона вижила лише завдяки непокорі королю та його урядовцям. Замість зміцнити королівську владу Берестейська унія лише підірвала її. Як і у випадку з Люблінською унією, об’єднання створило наслідки, протилежні тим, що на них сподівалися його ініціатори.
Боротьба за і проти унії не обмежилася сеймами й потрапила на ширшу громадську арену за допомогою публікацій. На території України та Білорусі стався справжній вибух трактатів, протестацій, друкованих атак і контратак, відомих сьогодні під загальною назвою «полемічна література». Спочатку обидві сторони були погано підготовлені для того, щоб вести серйозну релігійну полеміку, і користувалися послугами своїх польських прихильників. Петро Скарга, єзуїт, який узяв участь у Берестейському соборі, був серед тих, хто використовував своє перо на підтримку унії. Острозький користувався талантами своїх протестантських колег, щоб боротися проти унії. Протестанти завжди писали під псевдонімами (зазвичай грецькими), щоб підкреслити православне походження та авторитет своїх текстів. Більшість ранніх трактатів написана польською, яку продовжували використовувати і в пізніший період, коли місцеві автори почали писати руською.
Із часом і уніати, і православні почали використовувати авторів із власного середовища, які могли б по-іншому поглянути на питання релігійної політики, церковної історії, теології. Серед православних найбільшу популярність здобув Мелетій Смотрицький, син одного з редакторів «Острозької Біблії» — Герасима Смотрицького. Людина багатьох талантів, Мелетій був також автором першої граматики церковнослов’янської мови, що стала стандартним довідником з цього питання не тільки в Україні та Білорусі, але також у Росії протягом наступних двох століть. Судячи з кількості публікацій, православні були активнішими, ніж уніати, можливо, тому, що їм не вистачало інших каналів для захисту своєї справи, а також підтримки в королівських судах.
Берестейська унія та зростання козацтва призвели до зсуву на південь і схід двох основних культурних кордонів України — християнсько-мусульманського та поділу між східним і західним християнством. Цей зсув призвів до низки істотних змін в економічному, соціальному та культурному житті України. Одним з найбільш тривалих зрушень стало повернення Києва в центр української історії — уперше після монгольської навали XIII століття. У першій половині XVII століття це стародавнє місто стане центром православної реформації — зусиль з боку православних церков від Константинополя до Москви, спрямованих на те, щоб наздогнати Реформацію і Контрреформацію в Європі та реформуватися під час цього процесу.
